背根神经节电穿孔转染神经元技术的改进
背景：背根神经节电穿孔技术是一种研究神经再生的高效基因转染方法，以往背根神经节电穿孔的电压条件使得标记的神经元及轴突数目较少，统计误差较高。
目的：提高神经元及其轴突的标记率，为周围神经再生的研究提供理论依据。
方法：以增强型绿色荧光蛋白为观察指标优化背根神经节电穿孔技术在神经元轴突再生方面的应用。将ICR小鼠随机分为2组，分别行背根神经节电穿孔手术，检测在35 V和60 V电压干预下神经元及其轴突的标记率。
结果与结论：①35 V和60 V电压未造成神经元明显死亡；②与35 V电压相比，60 V电压条件下标记的神经元及其轴突数量显著增加，且通过损伤部位的轴突数量明显增多(P<0.05)；③60 V电压对实验动物未造成行为功能损害；④结果表明，60 V电压能够使神经元及其轴突的标记率增高，其结果能够为周围神经元轴突再生研究提供依据。
BACKGROUND:Electroporation of dorsal root ganglion is a high-efficiency gene transfection method to study nerve the past,the voltage condition of dorsal root ganglion electroporation resulted in a reduction in the number of labeled neurons and axons,with a high statistical error.
OBJECTIVE:To improve the marker rate of neurons and their axons,and to provide theoretical basis for the study of peripheral nerve regeneration.
METHODS:The enhanced green fluorescent protein was as an outcome measure to optimize dorsal root ganglion electroporation in axonal mice were randomly divided into two groups,respectively,and underwent dorsal root ganglion electroperforation surgery to detect the labeling rates of neurons and their axons under the intervention of 35 and 60 V voltages.
RESULTS AND CONCLUSION:Voltages at 35 and 60 V did not cause significant neuronal with 35 V voltage,60 V voltage significantly increased the labeling rate of neurons and their axons as well as the number of axons passing through the injured site(P<0.05).The 60 V voltage did not damage the behavioral function of the experimental results suggest that 60 V voltage can increase the labeling rate of neurons and their axons,providing a basis for the study of axonal regeneration in peripheral nerves.
0 引言 Introduction
交通、建筑业、工农业机械化的快速发展，以及自然灾害、医源性损伤等原因，使得周围神经损伤的发病率逐年上升。上述损伤原因中，交通事故导致的周围神经损伤约占46%，其中55岁以下患者约为83%[1]。近年来中国周围神经损伤的发病率虽呈现下降趋势，但仍为美国的8.2倍[2]。医源性损伤多以过度牵拉、压迫性损伤、术中直接损伤等原因多见[3-5]。损伤后周围神经仍旧保留内源性再生能力，以背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)轴突再生为主[6]，因此精准高效的轴突标记显得尤为重要。背根神经节电穿孔技术就是一种标记周围神经轴突的方法，据文献报道电穿孔时脉冲频率和电压的高低会影响电穿孔效率，脉冲频率过高会导致细胞死亡[7]。为此，作者拟通过改变电压的方式，探究电压高低与转染效率之间的关系，以此来提高对神经元及其轴突的标记率，从而增加背根神经节电穿孔技术在神经再生领域的应用性。作者前期预实验结果表明，在90 V电压下电穿孔后出现背根神经节组织电灼伤，组织破损较严重，故而选择了35 V与90 V中间的电压，即60 V进行实验。该实验使用35 V和60 V两种电压，在体内对背根神经节进行电穿孔，通过坐骨神经夹伤模型对优化的电穿孔条件进行验证。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 优化电压水平，对比观察动物实验。
1.2 时间及地点 2019年3至9月在苏州大学骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 质粒 实验使用的EGFP质粒(载体为 pEx-4，购买于上海吉玛生物有限公司)通过试剂盒(天根)进行提取，提取完成后可见白色DNA沉淀附着于1.5 mL离心管管底，然后对质粒进行浓缩，无菌水将提取的质粒DNA溶解成质量浓度为2.0-3.0 g/L的悬浮液。
1.3.2 显微注射器 通过微拔管器(NARISHIGE仪，PC-10型)在58℃下将10 cm的毛细玻璃管拉伸，拉成70 μm直径的微量注射针。
1.3.3 药品和试剂 生理盐水、二水合磷酸氢二钠、十二水合磷酸二氢钠、氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)；多聚甲醛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；蔗糖(上海源叶生物科技有限公司)；OCT冷冻切片包埋剂(北京雅安达生物技术有限公司)。
1.3.4 实验动物 8-10周龄ICR小鼠32只，雌雄各半，体质量20-40 g，饲养于苏州大学SPF级动物房内。所有涉及动物的实验均通过苏州大学实验动物伦理委员会备案。
